如何处理样品中的杂质

在植物可溶性蛋白检测中，“杂质"通常指两类物质：
干扰测定的化学物质： 如色素（叶绿素、花青素）、多酚类物质、单宁、还原糖、有机酸等。
物理杂质： 如细胞壁碎片、未破碎的组织、沉淀物等。
如果不去除这些杂质，会导致吸光度异常（偏高或偏低）、反应液浑浊、或者蛋白被降解。以下是针对不同杂质的处理策略：
一、 针对色素和光合色素（叶绿素）的处理
植物叶片（尤其是绿色叶片）中富含叶绿素，它不仅本身有颜色，还会与考马斯亮蓝染料竞争结合或产生沉淀。
处理方法：
使用 PVP 或 PVPP（最chang用）：
原理： 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）是多酚和色素的特异性吸附剂。
操作： 在提取缓冲液中加入 1% - 2% (w/v) 的PVP（不溶性PVP即PVPP效果更好，离心时容易沉降）。研磨前加入，它能通过氢键吸附多酚和色素，离心后随沉淀去除。
丙酮/乙醇洗涤（针对高含量叶绿素）：
如果样品叶绿素含量极gao（如幼嫩叶片），PVP难以wan全去除。
操作： 在离心前，向上清液中加入少量预冷的80%丙酮或乙醇（不要太多，否则会变性蛋白），混匀后离心。叶绿素会溶于上层有机相，蛋白沉淀在水相或界面（需注意此操作可能导致部分疏水性蛋白丢失，一般仅用于ji端情况）。
替代方案： 使用高浓度的提取液稀释样品，使色素的吸光度在595nm处的影响可以忽略不计。
脱色柱（层析法）：
对于非常复杂的样品，可以通过Sephadex G-25凝胶柱进行脱盐和去除小分子色素。
二、 针对多酚、单宁和醌类的处理
这些物质极易氧化（变褐），并与蛋白发生共价交联（醌-蛋白反应），导致蛋白沉淀或测定值偏低。
处理方法：
抗氧化剂：
在提取液中加入 β-巯基乙醇 (0.1%-0.5%) 或 二硫苏糖醇 (DTT) (1-5 mM)。它们能防止多酚氧化，保护蛋白巯基不被破坏。
注意： 过量的还原剂可能干扰Lowry法或BCA法，但在Bradford法中通常影响较小，若浓度过高需做对照。
螯合剂：
加入 EDTA (1-5 mM)，螯合金属离子，阻断多酚氧化酶（PPO）的活性，防止褐变。
防止酸性环境：
多酚氧化酶在酸性条件下活性较强，提取液通常调节至 pH 7.0-8.0。
三、 针对物理杂质和细胞碎片的处理
这是最基本的净化步骤。
处理方法：
多层纱布/尼龙网过滤：
研磨后的匀浆液，先用 4-8层纱布 或 100-200目尼龙网 过滤，去除未磨碎的组织、大的纤维和砂粒。这一步能防止离心管沉淀过硬或损伤移液枪头。
高速冷冻离心：
温度： 必须是 4℃。低温既能沉淀杂质，又能防止蛋白降解。
转速和时间： 通常为 10,000 - 15,000 rpm (或10,000g - 20,000g)，离心 15-20 分钟。
关键点： 取上清液时，务必小心不要吸起底部的沉淀层。如果上清液浑浊，说明离心不够，需要重新高速离心。
四、 针对还原糖、脂质和次生代谢产物的处理
处理方法：
TCA/丙酮沉淀法（“脏"样本的终ji净化）：
如果样品非常复杂（如果实、种子、富含树脂的植物），简单的缓冲液提取无法去除杂质。
操作：
将样品磨碎后，加入 10% 三氯yi酸 (TCA) 的预冷丙酮溶液（含0.07% β-巯基乙醇）。
振荡，-20℃沉淀过夜。
离心，弃去上清（此时糖、脂质、色素都溶解在丙酮中）。
用冷丙酮洗涤沉淀2-3次，直至沉淀变白。
挥发干丙酮后，用裂解液（如含SDS或NaOH的溶液）重新溶解蛋白沉淀。
优点： 极其纯净，去除了绝大多数小分子杂质。
缺点： 步骤繁琐，部分蛋白可能在沉淀过程中丢失。
稀释法（最jian单）：
如果杂质浓度不高，通过稀释样品来降低杂质浓度，使其干扰低于仪器的检测误差范围。
核心口诀：
低温加PVP  纱布去渣滓
离心取上清  抗氧化保真