植物ELISA试剂盒预实验操作流程

植物ELISA试剂盒预实验的核心目的是摸索最佳实验条件，排查样本、试剂兼容性问题，避免正式实验因条件不当导致失败。

其关键操作步骤和核心目标如下：

1. 样本稀释度筛选：用1-2个代表性样本，设置3-5个梯度稀释度（如1:10、1:50、1:100等），确定能使检测值落在试剂盒标准曲线线性范围内的最佳稀释比，避免信号过强或过弱。

2. 试剂有效性验证：快速检测试剂盒内关键试剂（如酶标抗体、底物）是否在有效期内且活性正常，通过阳性对照和阴性对照的信号差值，判断试剂是否可用。

3. 干扰因素排查：检测植物样本中可能存在的色素、多糖、酚类物质是否会干扰检测（如导致背景值过高），提前确定是否需要增加样本纯化步骤。

1. 实验前准备（0.5h）

◦ 试剂准备：将试剂盒内所有试剂（标准品、酶标抗体、底物、洗涤液等）从冰箱取出，在室温下平衡30min，避免温差影响试剂活性。

◦ 样本处理：选取1-2个代表性植物样本，按试剂盒说明书的样本提取方法（如研磨、离心）制备样本上清液，确保无杂质残留。

◦ 器材准备：提前清洗酶标板、移液器吸头，检查酶标仪是否正常工作，设定好检测波长。

2. 样本稀释度梯度设置（0.5h）

◦ 取制备好的样本上清液，用试剂盒配套的稀释液设置3-5个梯度稀释度（如1:10、1:50、1:100、1:200、1:500），每个稀释度做2个重复孔，同时设置空白对照孔（仅加稀释液）和标准品孔（按说明书稀释标准品）。

3. 加样与孵育（1.5-2h）

◦ 按顺序向酶标板各孔中加入50-100μL对应稀释度的样本、标准品或空白液，轻轻振荡酶标板使液体混匀，用封板膜密封。

◦ 将酶标板放入37℃恒温孵育箱中孵育1-1.5h（具体时间以试剂盒说明书为准），让抗原与抗体充分结合。

4. 洗涤与加酶标抗体（1h）

◦ 孵育结束后，撕掉封板膜，弃去孔内液体，用洗涤液充分洗涤各孔（每孔加200-300μL洗涤液，静置30s后弃去），重复洗涤3-5次，最后一次洗涤后将酶标板倒扣在吸水纸上拍干，避免残留液体影响后续反应。

◦ 向各孔中加入50-100μL酶标抗体，再次用封板膜密封，37℃恒温孵育30min-1h。

5. 二次洗涤与加底物（0.5h）

◦ 酶标抗体孵育结束后，重复步骤4的洗涤操作，确保洗去未结合的酶标抗体。

◦ 立即向各孔中加入50-100μL底物溶液（如TMB），轻轻混匀，37℃避光孵育10-20min，观察孔内颜色变化（一般阳性孔会逐渐呈蓝色）。

6. 终止反应与读数（0.5h）

◦ 当标准品孔出现明显梯度颜色时，向各孔中加入50μL终止液（如硫酸溶液），轻轻振荡混匀，孔内颜色会由蓝色变为黄色，终止反应。

◦ 10min内将酶标板放入酶标仪中，在规定波长（如450nm）下测定各孔的吸光度（OD值），记录数据。

7. 结果分析（1h）

◦ 根据标准品的OD值绘制标准曲线，计算出标准曲线的回归方程。

◦ 将样本各稀释度的OD值代入回归方程，计算出对应稀释度下样本的目标物质浓度，筛选出OD值落在标准曲线线性范围内（通常OD值在0.2-2.0之间）的最佳样本稀释度。

◦ 同时观察空白对照孔OD值（应接近0）和试剂反应情况，判断试剂是否有效、样本是否存在干扰，确定正式实验方案。